La normalisation des méthodes d'analyses concernant la flore anaérobie

ARCHIVAGE THEMATIQUE DES MESSAGES DU FORUM HYGIENE		Page mise à jour : 02/03/07
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THEME : La normalisation des méthodes d’analyses concernant la flore anaérobie
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j'aurais besoin d'aide sur les méthodes d'analyses qu'on utilise pour la recherche des clostridium de façon générale et pour les bactéries anaérobies sulfito-réductrices. J'aimerais connaitre les protocoles.
De plus, existe-t-il une réglementation concernant ces types de germes sur la matrice lait?

Concernant les méthodes d'analyses vous avez plusieurs méthodes expliquées dans les normes AFNOR XP V08-061 pour les ASR (à 46°C ou 37°C : je vous conseille plutot le milieu TSC) et V08-056 pour les Clostridium perfringens.

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Philippe Sommer
Directeur
Laboratoire Transal
za Belair
F-56250 La Vraie Croix
Tel (33) 2 97 67 28 28
Fax (33) 2 97 67 27 09

Je cherche une méthode d'analyse pour le dénombrement de la flore anaérobie totale. Existe il une méthode de référence ? Tout simplement j'aurais tendance à procéder de la manière suivante :
ensemencement double couche dans une gélose PCA et incubation en anaérobiose à 30°C (ou peut être 37°C ?) pendant 72H.
Malheureusement je ne suis pas du tout certaine que ce protocole me donnera une information fiable.

Il n'existe pas vraiment de protocole d'analyse pour le dénombrement de la flore anaérobie totale car les bactéries anaérobie sont très fragiles (vis à vis de l'O2) à l'exception de quelques espèces.

Vous mettiez en avant la technique de double couche sur P.C.A. (en boite) pour le dénombrement de la flore anaérobie. Il faut savoir que cette technique est réservée pour le dénombrement de la flore aérobie anaérobie facultative et que la double couche utilisée facultativement n'est pas pour mettre la 1ère couche en condition d'anaérobiose mais pour éviter l'envahissement de certaine bactérie à la surface de la gélose.

Mon conseil est :

a.. d'utiliser une milieu P.C.A non pas en boite mais en tube (permettant de mettre les bactéries en condition d'anaérobiose).
b.. ou d'utiliser un milieu Schaedler gélosé à 0.2%
En espérant avoir un commentaire de mon conseil,

Julien ZIMMERMANN

bonjour, votre technique ne se prête pas à la recherche des anaérobies stricts pour lesquels l'O2 est toxique (comme quoi tout n'est pas bon dans le bio...)
-Si vs voulez les "sulfito-réducteurs" sporulés chauffez à 65 -70 °C pdt 20 mn puis ensemencez des tubes milieu Viande-Foie ou équivalent (diamètre plus petit possible)
- Si vous voulez Flore totale anaérobie sticte ne pas chauffer avant d'ensemencer
Autrefois les microbiologistes utilisaient des tubes "maigres" que l'on pouvait limer et récupérer le "boudin" de gélose qui contenait la colonie à identifier - cf ? Bio-Rad catalogue Bactério-Alimentaire ou AES ou Difco-BD)
Sinon utilisez des tubes avec une gélose type Schaedler qui est dévolue à la recherche des anaer

Je souhaite compléter la réponse de Mr Alain Ros qui propose d'ensemencer un tube V.F. (Viande Foie) pour la recherche des Clostridium Sulfito-Réducteurs (=Clostridium perfringens).

La V.F. permet effectivement un développement des bactéries Anaérobies mais également de toutes les bactéries Aérobies (qui sont prototrophes = qui n'exige pas de facteurs de croissance), donc qui ne convient pas au dénombrement des Clostridium Sulfto-Réducteur.

Pour la recherche des Clotridium Sulfito-Réducteur une technique à ma connaissance est fiable :

Ensemencement d'une gélose en tube T.S.N. (Trypcase, Sulfite, Néomycine).

PRINCIPE :

Ce milieu permet l'isolement sélectif de Clostridium perfringens par la mise en évidence de son pouvoir réducteur sur les sulfites.

Actuellement la gélose TSN incubée à 46°C est un des milieux donnant les meilleurs résultats qualitatifs et quantitatifs pour le dénombrement à partir de produits alimentaires.

UTILISATION :

L'incubation à 46°C rend le milieu hautement sélectif de C. perfringens. La Néomycine contenue dans le milieu inhibe le développement des entérobactéries.

Il est recommandé de placer les cultures en jarre sous atmosphère anaérobie (mais ce n'est pas obligatoire).

MODE OPERATOIRE :

a.. Préparer l'inoculum avec un volume précis (en réalisant des dilutions successives de l'aliment en eau Physiologique).
- Verser le milieu en surfusion dans le tube avec l'inoculum. Mélanger sans faire de bulles, puis solidifier le milieu en plaçant le tube fermé sous l'eau froide.

Incuber pendant 24 à 48H à 46°C.

LECTURE :

Compter les colonies noires et en déduire le nombre de Clostridium par gramme ou par mL de l'aliment

UNIVERSITE DE GUELPH NEWSLETTER Septembre 2002. Au sommaire :
http://ahl.uoguelph.ca/News6-3/ANwsl6-3.pdf
Clostridium perfringens genotyping, a valuable component of the diagnosis!

J'aurais une question sur le denombrement des Clostridium perfringens selon la methode AFNOR V08-056 : lorsque qu'aucun traitement thermique préalable n'est appliqué (80°C pendant 10 minutes), dénombre t on uniquement les formes végétatives ou dénombre t on les formes végétatives et les formes sporulées ?

mon avis on dénombre les deux. parce la forme végétative va priliférer naturellement en milieude culture sélective et de même les spores vont être activées en se trouvant dans un milieu favorable à leurs croissances, mais peu être avec léger retard.

Normalement sans chauffage prélable, seules les formes végétatives vont être dénombrées.
Après chauffage, normalement les formes sporulées sont "activées" donc dénombrées tandis que les formes végétatives sont éliminées.
Si on veut donc dénombrer les formes végétatives et sporulées, il faut réaliser les deux dénombrements en parallèle et les additionner.

je suis tout à fait d'accord mais je pense que sans chauffage les spores peuvent passées à l'état végétatif.
théoriquement les industriels des conserves font plusieurs cycles de traitement thermiques en jouant sur les barèmes des traitements pour s'assurer de passage des spores à la phase végétative à fin de les éliminer.
mais ce ci ne signifie pas que les spores ne seront activées que par la température.

Ce que vous décrivez (voir extrait de votre message ci-dessous) n'est autre que la tyndallisation. Ce procédé ne permet pas d'obtenir des conserves, comme vous l'écrivez. Seule l'appertisation le permet. Les produits
tyndallisés peuvent être assimilés à des produits pasteurisés à conserver au froid. Voyez Cerf, O. (1990). La tyndallisation : come-back ou has-been ? I.A.A. 107: 1157-1158.

Pour le dénombrement des anaérobies sulfito-réducteurs, les normes afnor imposent l'utilisation du milieu TSC (tryptone sélénite cyclosérine, norme XP V 08-061). L'inconvénient de ce milieu, c'est qu'il n'est pas disponible dans le commerce sous forme prête à l'emploi du fait de l'instabilité de la D-cyclosérine en solution.
En terme de mise en oeuvre, c'est assez gênant car il faut préparer des tube d'eau de 5 ml, puis la stériliser, solubiliser la cyclosérine et enfin en pipetter 0,2 ml dans les tube de milieu.
Je cherche donc des "trucs" pour faciliter la mise en oeuvre de ce milieu.

Il existe un milieu prêt à l'emploi TSC pour les ASR chez les laboratoires AES.
Dans notre labo, nous utilisons ce milieu après consultation de notre responsable contrôle Qualité.

Non, il n'est pas prêt à l'emploi, il faut rajouter la cyclosérine dans les tubes de milieux. Ou alors le technicien que j'ai eu au téléphone s'est planté et à ce moment là je suis preneur de la référence !

Monsieur, j'ai travaillé sur l'analyse d'eau dans plusieurs laboratoires et j'ais été amené à utiliser du TSC prêt à l'emploi; je ne me rappelle pas le nom des fournisseurs mais il était soit en tube de 5ml soit en flacon de 125ml. Il suffisait de régénerre le TSC au bain marie sans ajout d'autre substance.
Si vous voulez les noms des laboratoires, vous pouvez me contacter.

Pourriez vous m'éclairer sur les différences entre ces deux normes, car selon l'afnor, il n'agit pas d'une mise à jour, mais bien de deux normes différentes ?
Existe-t-il des différences techniques (milieu utilisé, température d'incubation, ...) ?

a.. NF ISO 15213. - Microbiologie des aliments. - Méthode horizontale pour le dénombrement des bactéries sulfito-réductrices se développant en conditions anaérobies (indice de classement : V08-029) d'août 2003..
b.. XP V 08-061 - Microbiologie des aliments - Dénombrement en anaérobiose des bactéries sulfito-réductrices par comptage des colonies - méthode de routine d'octobre 1996.

La première est une norme internationale dite horizontale (le protocole est validée, par l'ISO, plus lourde en général), l'autre , la NF est une norme francaise, non reconnu "officiellement à l'étranger", qui est en général plus allégée.

Pour remplacer TSC + décyclosérine, on m'a parlé récement d'un milieu pret à l'emploi : TSN. Par contre, je n'ai pas plus d'info et je ne sais pas qui le commecialise.

Ce milieu est reconnu comme moins bon pour dénombrer ASr et Clostridium que le TSC.

Merci de vos précisions sur l'énigme suivante, portant sur des analyses faites sur des produits végétaux cuits et séchés :
* Recherche de Clostridium (sulfito réducteurs) : < 10 / g
* Recherche d'ASR (anaérobies sulfito réducteurs) selon norme NF: diverses valeurs, allant de 0 à 400 / g (hétérogénéité ?)

Je crois comprendre que les Clostridium ne sont pas les seuls anaérobies sulfito réducteurs mais y a-t-il effectivement possibilité que la détection des ASR selon norme NF mette en évidence des ASR qui ne soient pas des Clostridium, et dans ce cas quels peuvent être ces germes ?
Sont-ils à risque ?
Enfin sur quoi porte exactement la réglementation en vigueur (Clostridium ou ASR plus largement ?)

Pour l'heterogeneité vous aurez la réponse si vous faites les deux tests en parallèlle à partir de la meme suspension mère.
Qu'entendez-vous par Clostridium ? En effet si il s'agit de Clostridium perfringens vos résultats sont cohérents. (ASR > Clos perf). D'ailleurs selon l'arreté du 28/05/97 C.perfringens doit etre dénombré dans les préparations à base de végétaux cuits (m=100 ; M=1000)
les ASR sont par compte dénombrés pour les légumes surgelés par ex. Par ailleurs savez vous si les dénombrements ont été réalisés tous les deux à la meme température ou non (à 37 ou 46 °C) car les deux possibilités existent selon les NF et peuvent induire des petites différences.
En bactériologie alimentaire on assimile Clostridium SR à ASR. Attention certains Bacillus peuvent donner des réponses positives au test ASR en fonction du milieu de culture utilisé.

Question analyses Clostridium

Je vous écris pour que vous m'aidiez à démêler mes doutes entre ASR, Clostridium anaérobies sulfito-réducteurs, Clostridium perfringens.
En effet pourriez vous me dire pour chaque cétégorie:
Qui sont-ils? dans quels cas on les dénombre? sur quel milieu on les recherche? Quelle température d'incubation est utilisée?

Anaérobies sulfitoréducteurs et Clostridium.

La difficulté des définitions est liée à celle des techniques utilisées, car celles-ci ne mettent pas toujours en évidence ce que l'on dit.
Quand un chauffage préalable de l'échantillon est réalisé, on peut estimer que seules les spores (endospores) ont survécu.
L'incubation étant anaérobie, on estime que les anaérobies sulfitoréducteurs sont des anaérobies STRICTES (ce qui n'est pas tout à fait juste) et donc appartiennent, aujourd'hui, au genre
Clostridium. D'où la dénomination Clostridium sulfitoréducteur. (la plus juste serait spores d'anaérobies sulfitoréducteurs). Ce chauffage est réalisé (ou était) pour l'eau seulement.

Mais, si aucun chauffage n'est fait, il n'est pas possible d'affirmer « spores de », ou « Clostridium ». La mention Anaérobies sulfitoréducteurs à la température d'incubation choisie (46°C par ex.) est donc parfaitement juste (on ne précise pas alors si les Anaérobies sont ou non stricts).

Enfin, quand l'incubation est réalisée à 46°C en présence de cyclosérine, on estime (de façon un peu rapide) que les germes sont des Clostridium perfringens. Toutefois, il est possible de réaliser une identification après l'isolement (technique en boîte) et d'assurer alors l'identification. Je n'ai pas la norme sous les yeux, mais cela doit y figurer). Dans ce cas, l'affirmation Clostridium perfringens devient juste.

Donc, ces trois expressions peuvent paraître confuses, mais sont profondément liées aux techniques et à la volonté d'être précis quant aux conclusions. On retrouve la même chose avec Coliformes thermotolérants au lieu de fécaux, rien ne prouvant qu'à 44°C seuls les fécaux sont isolés.

Dernière ambiguïté sur les Anaérobies sulfitoréducteurs : l'interprétation !
En effet, ces germes sont fécaux mais le danger vient de C. perfringens, cause d'infection d'origine alimentaire pour des souches hypersporulées productrice de toxine A. En trouver prouve donc la contamination fécale et si les C. perfringens sont identifiés, le danger probable (en fonction des critères
évidemment), de l'aliment.

J'espère que les colistiers pourront amender ou contredire ces propos. Merci d'avance.

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Jean-Noël JOFFIN
Professeurs au Lycée Paul Eluard SAINT DENIS
mail : jnjoffin@voila.fr
Site internet : http://www.techmicrobio.net

Je suis à la recherche d'une méthode me permettant de répondre à l'absence ou à la présence de clostridium par gramme dans un produit de type farine. Quelqu'un pourrait il me renseigner à ce sujet.

Nous utilisons une adaptation de la méthode V08-056 : incubation de 10 ml de la suspension mère en bouillon thyoglycolate 2x puis repiquage en lactose sulfite avec cloche de Durham.

Laurence LASSAGNE Wed, 2 Feb 2005 10:01:12 +0100

je suis en train de remettre à jour les protocoles d'analyses au sein de notre laboratoire interne et je me pose une question sur la température d'incubation des ASR : 46°C ou 37°C ? Dans la norme les 2 sont possibles ?
pour info nous analysons des salades traiteurs

merci

MARTIN Miguel Wed, 2 Feb 2005 10:26:59 +0100

Les normes sont une chose, la réglementation une autre! Regardez la t° des ASR dans les textes spécifiants des seuils reglementaires vous y trouverez votre réponse.Laurence

LASSAGNE Wed, 2 Feb 2005 10:48:01 +0100

Merci pour l'info effectivement je n'avais pas penseé à regarder sur les critères réglementaires

alaoui lalla chrif Vendredi 16. Février 2007 10:11

bertrand CARLIER a écrit :
bonjour,

en recherchant sur le net, suite à une question du moment, je suis
tombé sur ceci :

Qualité de l'eau - Recherche et dénombrement des spores de
microorganismes anaérobies sulfito-réducteurs
(clostridia)
http://www.mtpnet.gov.ma/Normes_DAT/pnm%20ISO_6461-2.pdf

Correspondance
La présente norme reprend intégralement la norme ISO 6461-2/1986.

Donc, un état est en droit de reproduire l'intégralité d'une norme
ISO d'une part et la rendre accessible à tous d'autre part .

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alaoui lalla chrif Vendredi 16. Février 2007 10:11

Eric Kalinowski Vendredi 16. Février 2007 10:33