Hubert BAZIN Fri, 3 Feb 2006 13:30:54 +0100

Il y a quelques jours, je demandais à notre ami colistier le "débactériseur masqué" (qui ne nous parle plus de son procédé miracle ?) de nous parler des normes d'efficacité. Pas de réponse. Alors je vais apporter un élément au débat.

La norme NF T 72-231 (Août 1988) "Antiseptiques et désinfectants utilisés à l'état liquide, miscibles à l'eau : Détermination de l'activité sporicide" est utilisée pour déterminer si un produit possède, ou ne possède pas, une activité sporicide.

Sur la page de garde, on peut lire : "Analyse : Cette détermination permet de porter un jugement sur la qualité des produits utilisés comme antiseptiques et désinfectants et de les comparer dans des conditions reproductibles. Elle est menée en laboratoire (in vitro) dans des conditions déterminées et permet d'apprécier une inactivation d'au moins 99,999 % des spores bactériennes de différentes espèces".

Lisons plus loin

2.1.5 "Les souches de bactéries sporulées retenues correspondent à un éventail représentatif des populations les plus fréquemment rencontrées. La souche Bacillus subtilis variété niger constitue un étalon international pour les agents sporicides. (..) B. cereus représente une espèce ubiquiste proche de l'espèce pathogène B. anthracis. Clostridium sporogenes est une espèce anaérobie extrèmement répandue (...)."

Question : ces spores sont-elles celles qui VOUS intéressent ?

Plus loin encore

"4.2 Détermination de l'activité sporicide : détermination de la capacité ou non d'un produit de réduire d'au moins 10^5 fois le nombre de spores vivantes appartenant à des souches déterminées de 3 espèces bactériennes, en 1 h à 20°C et (ou) en 5 min à 75°C"

Question : ces conditions sont elles représentatives de ce que VOUS pratiquez dans vos ateliers ? Saveiez-vous seulement qu'il fallait attendre aussi longtemps ? Les prescriptions du fournisseur font-elles apparaître une durée aussi longue - ou une température aussi élevée ? (pour mémoire, au-dessus de 60°C, on se brûle).

Toujours plus loin - et c'est là qu'on voit l'intérêt de bien tout lire :

"11.1 préparation des suspensions de spores et dénombrement (...)". En bref : on fait des suspensions, on les dilue en partant de 10^8 et en allant jusqu'à 10^-6, soit pas moins de 10 dilutions en cascade, au 1/10ème, on filtre 1ml de la dilution à 10^-6et on incube le filtre. "Après incubation, dénombrer les colonies et noter la moyenne (de 2 boîtes) correspondante N."

"11.2 essai du produit et dénombrement des spores (...)" En bref : on fait agir, on thermostate à 20°C ou à 75°C, on filtre et on incube les boîtes . "11.2.6 Dénombrer les colonies sur les membranes et noter la moyenne correspondante n (toujours sur 2 boîtes)"

Et enfin , l'apothéose

"12 expression des résultats (...) Les produits pour lesquels l'essai montre que la condition n=< N est vérifiée pour les 3 souches ont une activité sporicide dans les conditions de la présente norme".

Remarque:
Où voit-on la condition qui permettrait de dire "réduction d'un facteur d'au moins 10^5" ? Il est dit que le comptage des spores doit se faire à partir de la suspension à 10^-6, mais il n'est pas dit que l'on doit faire les essais sur des suspensions à 10^1...
Donc en lisant calmement la norme, il suffirait d'avoir N = 132 ufc pour les suspensions non traitées, et n = 112 pour les suspensions traitées 5 minutes à 75 °C, et ça pour les 3 souches, pour pouvoir affirmer que "Le produit a une activité sporicide dans les conditions de la norme NF T 72-231" ? Et ensuite on pourrait laisser supposer aux utilisateurs que le même produit, utilisé pendant 3 minutes à 8 ou 10 °C (mesurez donc la température de l'eau du réseau, froide, aujourd'hui) pourrait détruire les spores de C. botulinum ?

MICROBIOLOGISTES, FABRICANTS DE PRODUITS DE DÉSINFECTION : DITES-MOI QUE JE ME TROMPE, S'IL VOUS PLAÎT...

cordialement

Hubert BAZIN
conseil et formation

Olivier CERF Fri, 3 Feb 2006 14:29:58 +0100

Norme NF T 72-231 "Antiseptiques et désinfectants utilisés à l'état liquide, miscibles à l'eau : Détermination de l'activité sporicide"

J'ai sous les yeux la version de 1981. Après un chapitre intitulé "10. Essai préliminaire", il y a un chapitre intitulé "11. Essai proprement dit". Je recopie le premier paragraphe :
"11.1 Préparation des suspensions de spores et dénombrement des spores dans la suspension avant contact avec le produit soumis à
l'essai
En fonction du nombre de spores viables dans les suspensions (8.1) [suspensions de Bacillus] et (8.2) [suspension de Clostridium] et pour chaque souche, préparer des suspensions dans l'eau distillée ou le diluant préconisé par le fabricant pour le produit à essayer, contenant entre 1 et 3x10^8 [dix puissance 8] spores par millilitre.
Vérifier ces concentrations par dénombrement."

1/ Pour dénombrer les spores d'une telle suspension, et être capable de distinguer des colonies, il faut bien 6 dilutions au dixième, n'est-ce pas ?
2/ Sur une suspension avec une telle concentration de départ, il est bien possible de mesurer 5 divisions par dix (= une division par 10^5), n'est-ce pas ? Il restera entre 1000 et 3000 spores/mL, ce qui est facile à dénombrer après une seule dilution.

En quoi la version de 1988 diffère-t-elle de la version copiée ci-dessus ?

Hubert BAZIN Fri, 3 Feb 2006 23:18:02 +0100

Merci à Olivier CERF d'intervenir, mais ce n'est pas du jeu : il connaît les réponses :-))

Je réponds néanmoins :

version de 1988 Au chapitre modiifications, il est précisé "Par rapport à la précédente édition, les modifications portent sur l'amélioration du mode opératoire, l'interprétation des résultats qui ne seront plus quantifiés et la suppression de substances interférentes".

En ce qui concerne le paragraphe 11 de la version de 188, on lit, in extenso

11.1 Préparation des suspensions de spores et dénombrement des spores dans la suspension avant contact avec le produit soumis à l'essai.

Pour chaque souche, préparer des suspensions avec le diluant (7.9), contenant entre 0,5 et 1,5 x 10^8 spores viables par millilitre. A partir de ces dernières faire des dilutions au 1/10 jusqu'à 10^-6. Après agitation, à partir de la dilution 10^-6, effectuer 2 prélèvements de 1 ml, transférer chacun d'eux dans un appareil à filtration stérile. Filtrer et rincer dans les conditions déterminées en (10.3). Après incubation, dénombrer les colonies et noter la moyenne correspondante
N.


Puis, on passe au 11.2 : Essai du produit et dénombrement des spores. le 11.2.1 explique que l'on doit préparer des séries de 5 dilutions du produit à tester en concentration double de celle que l'on veut effectivement mettre en contact avec les spores. (normal : on va ensuite mettre 1 ml de suspension de spores, 4 ml d'eau et 5 ml de solution
désinfectante, qui va bien de ce fait se retrouver diluée de moitié.)

11.2.2 introduire 1 ml de chaque suspension de spores (11.1) dans un tube stérile en évitant soigneusement de contaminer la partie supérieure des parois du tube. Après addition de 4 ml d'eau, etc. etc.

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J'arrête de jouer (et de faire l'âne ?) (pour avoir du son ? je n'aime pas le son, ça grince sur les dents)

Je sais bien que l'on parle de SUSPENSION de spores dans un cas (suspension-mère, à 1.10^8 spores/ml), et de DILUTIONS de la suspension dans les autres cas. On a donc bien d'un côté un dénombrement sur une dilution de 1.10^8 x 10^-6 donc 1.10^2, soit 100 spores/ml, quantité tout à fait comptable sur un filtre. Et de l'autre côté, on va soumettre une suspension de 10^8 spores / ml , diluée au 1/10 par la suite (1ml de suspension + 4ml d'eau + 5ml de produit = 1 ml dans 10 ml) à un produit de traitement, et on espère ne pas compter plus de 100 ufc ensuite. On a bien alors dans ce cas une destruction de 99,999 % de la population de départ, ce qui fait bien 10^5. La norme n'est pas si stupide que ça, tout de même.

Ce que je voulais mettre en avant c'est :

1 - la norme ne me semble pas explicite à l'excès : on dirait simplement "introduire 1 ml de chaque suspension-MÈRE de spores, etc." et il n'y aurait plus de place pour l'interprétation. Je sais (vous savez, nous savons) que parfois les documents sont lus un peu ... rapidement. [Le danger serait bien évidemment de soumettre la dilution à 100 spores / ml au produit à tester : on aurait alors à peu près 50% de chances de déceler une activité, même si le produit à tester était de l'eau distillée ou de la confiture de
groseilles]

2 - les spores de référence ne sont pas forcément celles qui intéressent les industriels

3 - les conditions de réalisation du test sont assez éloignés des conditions praticables dans l'industrie (encore une fois : 60 minutes à 20°C ou 5 minutes à 75°C !)

4 - et quand on lit sur un emballage "sporicide selon la norme machin-truc", on ne veut retenir que "sporicide", et on veut entendre "sera donc efficace dans mes conditions d'application". Et ça, c'est loin d'être réalisé partout.

En conclusion : si l'on parle d'efficacité des désinfectants, il faut procéder à des tests en vraie grandeur, dans son installation, avec ses microbes et ses appareils. Et on teste des produits qui sont sporicides selon l'AFNOR, parce qu'ils ont alors un préjugé favorable.

Je vous prie de bien vouloir excuser ce mouvement d'humeur.

cordialement
Hubert BAZIN

Lundi 15. Octobre 2007 11:36

FOOD SAFETY MAGAZINE - Archives 2004 à 2007 Au sommaire:
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- The Challenge of Bacterial Spores